流式细胞术本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-P

流式细胞术
本实验室有bdC6,我想做TH1/TH2检测,用IFN-γ-FITC,IL-4-eFluor660,CD3-PE,CD8-PE-Cy7.

童鞋你这是个100分问题啊亲.

BD Accuri C6 我没有用过,我找到的laser和filter信息如下,假定你用的是标准配置（红框内）

你挑选的4个荧光已经分布到4个不同的通道,貌似可以共染色然后同时读取.具体有一些特别注意的地方分析如下：
1.efluor660的发射光谱同670LP filter的波段有严重重叠但是因为FL3和FL4由不同laser激发,我认为不会造成问题.
2.FITC与PE-Cy7都会有信号泄露到FL2 PE的通道.FITC与PE的共染色是常见的,compensation必做,可以解决问题.但考虑到它们全用同一个laser,这里PE激发效率本来也只有50-60%,PE-Cy7又是一个效率不高的tandem dye,恐怕会泄露过来很多PE信号.这种情况下,我真的不知道能否靠compensation来解决问题.

建议是楼主只做PE与PE-Cy7的双染色预实验（需要空白及两种单染色对照）,测试compensation的效果.如果没问题可以实施原本实验计划.
当然,如果楼主抗体还没有买好,还能改荧光,我建议买CD8-PerCP,直接不用做PE对它的compensation了啊啊啊啊啊.
以上是个人在理论上的理解,实际经验并不太多,欢迎网友指正.

以上光谱来自于ebioscience FluorPlan Spectra Viewer.

再问： 抗体我还没买，但是我找不到大鼠CD8-PerCP抗体，有其它别的抗体可以用吗？找到一个大鼠抗percp-eflour710，可以用吗，谢谢.
再答： 从波谱来看percp-efluor710激发得很好，发射峰也更靠右，应该是比percp更好的选择。只是我没有用过tandem dyes所以没有想到用它。但我也不知道tandem dye是否有什么缺点。
再问： CD3和CD8需要做同型对照吗？为什么呢
再答： 理论上来说，所有的抗体都需要做同型对照。原因也是由于相同的原因，摆渡百科有讲： 同型对照 同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。还可以用来竞争性的结合抗体，与功能阻断抗体发挥同样的功能。 同型对照要与一抗的来源，Ig分型和标记完全一致。 他其实更详细的，但太长，有兴趣你自己去看一下。 实际操作中来说，确实每次实验都做要耗费很多样本与试剂。我建议一个折中的办法就是对于某个特定的样本类型，做一次完整的同型对照，确定一下同型对照与完全不染色的空白对照样本结果一致，则在同类的实验当中，在保持一致的染色操作前提下，可以考虑以后使用不染色的空白对照作为对照。但是，如果同型对照确实含有一定的背景信号，比不染色的空白对照波峰有右移，则每次实验都做同型对照是不能够省掉的。但是再但是一下，考虑到你的CD3和CD8是高表达的分型marker，也就是说阳性群与阴性群将会有明显的分离，也就是说，你的实验组本身就带有自己的完美的对照（样本中的阴性细胞，比如你使用外周血单核细胞，就一定含有CD3-CD8-细胞）。不管你的同型对照做不做，你都不会遇到任何困难gate出你要的CD3+CD8+细胞群。所以，我认为对这两个抗体做不做同型对照不会影响你的结果，当然前提是你的染色条件适宜。但是对于其他抗体，需要精细地区分阳性和阴性，两者之间没有分界而是连续分布，则同型对照就非常重要。