我第一次接触PCR,还请大家多多指教

来源：学生作业帮编辑：搜搜考试网作业帮分类：生物作业时间：2024/05/16 11:20:14

我第一次接触PCR,还请大家多多指教
在设计引物时使用Primer Premier 5设计时显示的Tm值两条分别是64.8℃,64.6℃
用Oligo6时显示出三种方法计算的温度,其中
nearest neighbor法 upper 76℃ lower72.1℃
%GC法 upper 79.2℃ lower 75.9℃
[2(A+T)+4(G+C）]法 upper 70℃ lower 76℃
为什么相差这么多?我到底该相信哪个?
哪继续请问不是说Tm值和pcr成功与否有很大关系吗?如果两个引物Tm差太多是不是会对PCR有影响~我看那些经验啊原则啊都说需要Tm值接近,还说Tm值低几度就是退火温度.如果Tm差那么多退火温度岂不是会难确定~

首先告诉你,Tm值没什么用的,你要注意的是退火温度,比如这是我做16S rDNA的程序,
1）95度 10min（这个一般用94-95度,使DNA完全分开,这步一般固定）
2）95度 30秒（94度、95度都可以,这步几乎也是固定的）
3）退火温度 30-60秒（退火温度你设计引物时会有告诉你的,要是是大片段,将程序建议的退火温度减去5度,小片度就可以按照它给的温度,注意,退火温度是PCR的关键,所以一般需要摸索条件的）
4）72度延伸时间（这步固定,延伸时间与你P的片段大小和你的Taq酶有关,一般是1-2kb/min,也就是说你做1kb大小的片段就用30-60秒,依次类推）
步骤2-4循环30次
5）72度 5-10min
6）15度 10min（此步可有可无）
希望可以帮到你!
Tm值在你设计引物的时候才会有用,引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.不知道你懂了没? 当然,我引物Tm值差5度的也有,照样P的很好,呵呵.

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