设计实验:DNS法测糖化型淀粉酶活力

设计实验:DNS法测糖化型淀粉酶活力
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谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定 几乎所有植物中都存在淀粉酶.尤其是萌发的禾谷类种子.淀粉酶活性最强.主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶.种子萌发时.淀粉酶活性随萌发时间迅速增加.将淀粉分解成小分子糖类.供幼苗生长.α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1.4-糖苷键.作为淀粉分解的起始酶而起主要作用,其水解产物为麦芽糖.麦芽三糖.糊精等还原性糖,β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1.4-糖苷键.水解产物为麦芽糖.并能使一部分糊精糖化.本实验以萌发种子为材料.测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异.[原理] 两种淀粉酶具有不同理化特性.α-淀粉酶不耐酸.在PH3 6以下迅速钝化,β-淀粉酶不耐热.在70℃下15Min则被钝化.据此.在测定时钝化其中之一.就可以测定出另一种酶的活力.本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力.再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较.求出β-淀粉酶活力.淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3.5-二硝基水杨酸试剂反应.使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸.在一定范围内.其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比.可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示.用比色法测定淀粉生成的还原糖的量.以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力.[仪器与用具] 分光光度计,离心机,恒温水浴器,研钵,具塞刻度试管25Ml 13支.刻度吸管1ml.2ml.5Ml各1支,容量瓶50Ml 2支.[试剂] 麦芽糖标准液(1Mg/Ml):称取100Mg麦芽糖.用蒸馏水溶解并定容至100Ml.DNS试剂(3.5-二硝基水杨酸):精确称取3.5-二硝基水杨酸1g.溶于20Ml 12Mol/L NAOH溶液中.加入50Ml蒸馏水.再加入30g酒石酸钾钠.待溶解后用蒸馏水定容至100Ml.盖紧瓶塞.勿使CO2进入.若溶液混浊.可过滤后使用.0 1Mol/L PH5 6的柠檬酸缓冲液:A液(0 1Mol/L柠檬酸):称取分析纯柠檬酸21 01g.用蒸馏水溶解并定容至1L,B液(0 1Mol/L柠檬酸钠):称取柠檬酸钠29 41g用蒸馏水溶解并定容至1L,取A液55Ml与B液145Ml混匀.即为0 1Mol/L PH5 6的柠檬酸缓冲液.1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100Ml 0 1Mol/L PH5 6的柠檬酸缓冲液中.[方法] 1.酶液提取称取25℃下萌发3-4天的小麦种子1 0g(芽长1 0-1 5CM).置研钵中.加少量石英砂和2Ml蒸馏水.研磨成匀浆后转入离心管中.用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管.提取液在室温下放置提取15-20Min.每隔数分钟搅动1次.使其充分提取.然后在3000r/Min转速下离心10Min.将上清液倒入50Ml容量瓶中.加蒸馏水定容至刻度.摇匀.即为淀粉酶原液.吸取上述淀粉酶原液5Ml.放入50Ml容量瓶中.用蒸馏水定容至刻度摇匀.即为淀粉酶稀释液.2 麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管.编号.按表18-1加入试剂:表18-1制作麦芽糖标准曲线配方表 试剂管号1234567麦芽糖标准液(ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量(mg)00.20.40.81.21.62.03.5-二硝基水杨酸(ml)2222222摇匀.置沸水浴中煮沸5Min.取出后流水冷却.加蒸馏水定容至20Ml.以1号管作为空白调零点.在540nM波长下比色测定.以麦芽糖含量为横坐标.吸光度值为纵坐标.绘制标准曲线.3 酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管.编号.按表18-2进行操作.表18-2酶活力的测定配方表 操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液(ml)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15Min.取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液(ml)000111DNS试剂(ml)2.0002.000预保温40℃恒温水浴中保温10Min1%淀粉溶液(ml)(40℃)1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5MinDNS试剂(ml)02.02.002.02.0摇匀.置沸水浴中5Min.取出后冷却.加蒸馏水至20Ml.摇匀.在540nM波长下比色.记录测定结果.4 结果计算 用Ⅰ-2.Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差.在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg).再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα).淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg/g·Min)表示:Aα=CαVTFW×t×V1(18-1) Ⅱ-2.Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差.在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg).按式18-1计算(α+β)-淀粉酶的活性AT AT=CT×VTFW×t×V1 式中A:淀粉酶活性.Aα为α-淀粉酶的活性.AT为淀粉酶总活性.主要是α.β-淀粉酶的活性,Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值.以下同),CT:(α+β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量,V1:显色所用酶液体积(Ml),T:酶作用时间(Min),VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml.α+β淀粉酶为500Ml),FW:样品鲜重(g).[思考题] 1.萌发种子和干种子α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异 这种变化有何生物学意义 2 实验中设置对照的意义何在 3α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同 作用特点有何不同