不要书上那种好多方法的,要实际做过的按照每一步先做什么后做什么的顺序~

不要书上那种好多方法的,要实际做过的按照每一步先做什么后做什么的顺序~

分子克隆实验流程
第一天
一:目的片段的扩增（PCR）
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在.
1.PCR(50ul)
ddH2O 37.5ul
10x buffer 5ul
MgCl2（25mmol） 3ul
dNTP （10mmol） 1ul
primer 1（10mmol） 1ul
primer 2（10mmol） 1ul
cDNA 1ul
Taq 0.5ul
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注意：当所要扩增的目的片段较大时需要适当的增加延伸时间（一般产物越长,需要的时间越长：　1分钟/1kb）
2.琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样,150V恒压电泳20-30min,保存电泳图片.（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板.其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带侧需要割胶回收目的片段.
3.PCR产物纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用45ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
4.PCR产物酶切（50ul）
PCR纯化产物 43ul
10xBuffer Tango 5ul
E1 1ul
E2 1ul
酶切反应条件：37℃反应过夜或者37℃反应3-4h.
. PCR产物酶切纯化:根据PCR产物回收试剂盒上流程回收PCR产物,最后用25-30ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.
琼脂糖凝胶电泳检测：取2-5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样,150V恒压电泳20-30min,保存电泳图片.以确保回收到目的片段.

二．载体的制备
1．质粒DNA的制备：用柱式质粒DNA小量试剂盒抽提我们所要的载体质粒.
2.载体酶切（100ul）
质粒DNA 2ug
10xBuffer Tango 10ul
E1 2ul
E2 2ul
ddH2O 补足至100ul
反应条件：一般pGEX-4T 37℃水浴3-4h,pET系列37℃水浴过夜.
3. 琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样,150V恒压电泳20-30min,同时取200ng左右没有酶切的质粒做对照,保存电泳图片.（琼脂糖凝胶的配制:1xTAE缓冲液+琼脂糖 加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60℃以下加入EB混匀倒板.其中琼脂糖含量为1g/100ml,EB含量为0.1ul/ml）
4.酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上流程回收酶切产物,最后用20-30ul ddH2O洗脱-20℃保存或下一步实验.

第二天

三．外源DNA片段在质粒载体中的克隆
1.外源DNA片段与质粒载体的连接（10ul）
DNA片段 6ul
载体 2ul
T4 DNA Ligase 1ul
Buf T4 DNA Ligase 1ul
反应条件：22℃水浴3-4h或者16℃或4℃水浴过夜.
一般目的片段：载体摩尔比约为3:1,但是在这里我们通常是按体积比.
2.连接产物转化
取全部连接产物加入到不少于5-7倍体积感受态细胞溶液中,冰浴20min,42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基,37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h.4000rmp离心1min弃上清同时保留100-200ul混匀菌体沉淀后均匀涂布抗性平板上.37℃恒温箱培养过夜.
质粒转化
取质粒1ul或50-100ng加入50-70ul所需的感受态细胞溶液中,冰浴20min,42℃热激90s后静置与冰浴中3-5min加入500-800ul（一般800）LB或SOB培养基,37℃ 200rmp恒温培养0.5-1h.取100-200ul菌体均匀涂布抗性平板上.37℃恒温箱培养过夜.
注：1一定要区分质粒和连接产物转化的不同,不要理所当然.
2根据实验要求选择所需要的感受态.
3在选择抗性平板的时候要根据所选载体和感受态两个方面确定.

第三天

收集涂布的抗性平板检查菌落生长情况4℃保存待下一步实验;筛选鉴定或酶切鉴定

筛选鉴定
菌落 PCR(25ul)
ddH2O 19.2ul
10x buffer 2.5ul
MgCl2（25mmol） 1.5ul
dNTP （10mmol） 0.5ul
primer 1（10mmol） 0.5ul
primer 2（10mmol） 0.5ul
Taq 0.3ul
模板为单菌落
PCR反应条件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30 72℃ 5min.4℃保温 或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10 72℃ 5min.4℃保温
注：1一般一个项目要挑选5个单菌落做菌落PCR
2在以菌落为模板时要事先准备相应抗性平板,用枪头挑选菌落时要先在事先准备的相应平板上划线标记好顺序再将枪头放入上述反应体系中搅匀一下.
3该PCR 的primer 为通用primer 所以在原来目的片段的大小上加上100-200bp.
琼脂糖凝胶电泳检测：取5ul样品+5ul DNA Loading buffer混匀上样,150V恒压电泳20-30min,保存电泳图片.根据大小判断该菌落是否正确.下班前挑取（在划线的板子上）筛选正确的菌体接种到5ml 含相应抗性的LB培养基37℃ 200rmp培养过夜.