DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?

DNA或RNA样品不纯,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度的准确性会受到影响,为什么?

分光光度计
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器.常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量.核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA.核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰.吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性.但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量.
蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光.通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大.RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右.当样品中蛋白质含量较高时比值即下降.
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度.样品的吸光值与样品的浓度成正比.
核酸的定量
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,它们的吸收高峰在260nm波长处,每种核酸的分子构成不一, 因此其换算系数不同.定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数.如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA,37μg / ml 的ssDNA, 40μg/ml的RNA,30μg/ml的寡核苷酸.测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度,这些由分光光度计内预设的程序执行,因此,测试前选择正确的程序,测试样品的类型,首先测试空白液,然后再测试样品,注意输入样品稀释倍数.
如何避免吸光值漂移
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题.灵敏度越高的仪器, 表现出的吸光值漂移越大.事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度.
核酸本身物化性质
溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等
在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数.核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响.只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0）,才能得到精确的检测结果.水的pH值不稳定,可能导致检测误差.一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液.
样品的稀释浓度
同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品.这些小颗粒的存在干扰测试效果.为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A ,吸光值最好在0.1-1.5 A.在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定.从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高（超过光度计的测试范围）.
操作因素
如混合要充分,否则吸光值太低, 甚至出现负值；混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项.
各波长具体含义及相关问题1. A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1至1.0.如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内；如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素（如移液不准确,样品内有悬浮物等）影响.DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1.（请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值