单克隆菌落就一定是单基因型吗?

来源：学生作业帮编辑：搜搜考试网作业帮分类：生物作业时间：2024/06/05 04:49:12

单克隆菌落就一定是单基因型吗?
有个问题困扰我好久了,最近构建了一个工程菌,是将野生型菌株的一个启动子片段,连入T载体,再用同源重组的方法整合进野生型菌株基因组上的另一个位置,然后挑选阳性克隆测序验证.
但是纠结的是我对阳性克隆的插入片段进行PCR测序后,发现有套峰,于是T-A克隆后再测序,发现10个克隆子中多数有3个位点突变,与克隆前测序套峰的位置一致（见图片中红色框标注）,少数没有突变.因此认为是菌不纯,没跳到单克隆,然后将菌株稀释划线,又挑了很多单克隆测序,均发现有套峰,也就是一直没有得到基因型单一（或者都突变,或者都不突变）的菌株,这是为什么呢?
难道单克隆菌落在复制时不同细胞之间的基因组拷贝间也会有碱基差异吗?单克隆就一定是单基因型吗?

理论上单克隆菌落应该是基因型,或者这个菌株有些特别,易突变.
还有可能是这个菌株一菌株之间有粘连,你划线可能没有得到单克隆.
你可以试一下,取一点菌液,用培养基稀释,吹打,再涂板试一下.尽可能的让菌长得少一些.
再问：嗯，我也试过将一个但菌落溶解在1oul 水中，然后环线，长出的单菌测序后还是一样的结果
再答：你用菌的全基因测序吗？应该是干扰的原因太多，比如这个基本里面本身就含有几种近似的基因，同一引物，PCR的产物本身就是一个混合物。
再问：我是用溶于水的菌液做PCR模板，只扩增我克隆进载体的那一段片段，PCR产物直接测序（用扩增时的引物）或者PCR产物T-A后测序（用载体测序的通用引物）。
再答：理想的情况是只扩增你克隆进去的那一部分，但确实上，因为基因同源生比较高，可能未突变的也P出来了，这样结果就是产物并不单一。至少说明你突变成功了。但菌体内还有其他的没被突变的位点。
再问：但是我已经用同源重组的方法将片段连入菌的基因组DNA了，按理说如果这个目的片段在基因组中只有一个拷贝，那我的引物也只能结合在这里，为什么还会有突变和未突变的同时存在呢？
再答：细菌基因没有重复吗？启动子也没有近似的吗？
再问：应该是没有了，而且，我PCR的引物是扩增2个片段之间的连接位置（就是启动子和另一个报告基因的连接处），就算启动子有其他的拷贝或近似，不会也和报告基因连在一起吧？所以扩出来的片段应该就是我插入的片段吧？
再答：这个那我也不知道原因了。找一找菌株的原因看看，或者再重做一次。

单克隆抗体中单克隆指的是：我的单克隆菌落PCR除了很明确的目的条带外.在2000多上面还有微弱的两条带.不知道是什么条带.难道是菌的DNA?这样的菌落pcr是否可以直接扩增基因组上的目的基因?单菌落需要特殊处理吗生物的表现型是由基因型决定的.基因型相同,表现型一定相同；表现型相同,基因型不一定相同. 基因型为AaBB的父亲和基因型为Aabb的母亲,所生子女的基因型一定不可能是丁烯一定是单烯烃吗?我们平常说的丁烯一定是C4H8吗?一定是单烯烃吗? 用涂布平板法和划线法不能较好地得到了单菌落,这是为什么? 转化后挑取含有目的片段的单菌落摇菌扩增以后划盘子,几天后挑取部分菌落做PCR无带,不知是何原因? 现代汉语中,凡是单音节的词就一定是单纯词?对吗感受态制备时,为什么挑单菌落挑很多可以吗基因型相同的生物表现型一定相同吗,为什么 ?用高效价的感受态细胞挑单克隆,严格按照hanahan法制备感受态细胞.测效价完全长不出菌落的原因?