已知基因全长ORF克隆如何引物设计-搜答案-搜搜考试网

这是我们生物信息学中经常遇到的问题,最常用的方式就是就是到数据库--美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank--中用在线版的局部比对基本查询工具(BasicLocalAlignmentSe

cDNA不是被克隆出来的,而是mRNA反转录出来的.你现在要做的是克隆编码区全场,而不是cDNA.如果你有反转好的cDNA,序列也已知的话,直接在3'和5'非翻译区设计引物,以cDNA为模板,克隆出全

你看,你分别获得了1-1200nt以及1000-1400nt这两段序列,那么中间有200bp长度的序列是重叠的,对吧?也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息.如果你只是需要序列信息的

构建载体需要酶切的,所以需要加接头的!

首先要知道这段基因的序列,然后可以用软件来设计,如Primer我就知道这个,看到别人用,很好推荐

1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后

何必知道两侧,只需知道一侧就好有两侧的话,先将两侧分离,然后分别配对.就得到两个新的基因.而且一模一样抱歉

您应该使用巢式PCR来做这个实验.无论您是先提RNA再做反转录,还是直接从DNA中获得基因,考虑到模板的复杂性,都应当使用巢式PCR.建议您先从目的基因的上下游设计一段引物,即外引物,再根据目的基因上

可能是模板结构问题,多试几种PCR试剂,个人觉得Takara的LA扩增能力比较强

一般用primer设计,起始引物以atg开头,终止以taa,tga,tag结尾,不过你要先分析你的引物是不是全部能够翻译成蛋白质,不要有中断,否则你就算扩增出来也没用的

在NCBI中进行primerBLAST就可以了.

1.根据密码子或blast确定DNA序列.2.直接合成,或设计引物做PCR.

普通PCR是基因克隆的基础,原理一致.基因克隆在于所扩的序列是未知的,现在很多生物的全基因序列已经公布,多重序列比较设计简并引物,克隆出保守区域的片段,在通过RACE等方法把上下游的序列扩出来.

和从哪设计引物没关系如果编码区有突变的话那就肯定不行的最简单的就是拿去测序CDS区完全正确就可以了验证功能的话就做western以及检测该基因下游targets的表达量比如它可以促进A的表达就转染细胞

可以遵循的逻辑是比较已知的不同种属该基因序列,看看有没有很保守区.想要全长就很难了.:tiger05:ben1147(站内联系TA)EST库里blast找同源的,本物种里的est序列,拼接得到尽量长并

直接设计只要包含了整个CDS区就可以再问：哦，那CDS和ORF是一样的吗，怎么查找基因的CDS区啊再答：恩差不多回事ORF是DNA上的CDS是mRNA上的看你模板用的是基因组DNA还是cDNA了反正就

额

先把该全长基因测序,然后按照测序结果设计完全匹配的引物然后将设计的多个候选引物与ncbi中该物种的其它基因或者基因组进行比对,选择特异性最好的去做realtimePCR

我有一个关于primer5的使用技巧的文档,你需要的话可以给你,里面介绍很详细,其实引物设计都是很简单的,自己多试试就很简单了

建议你先上网学习一下引物设计最简单的一些知识我设计引物是用Omiga软件的,使用比较简单,只要新建一个核酸文件,把目的基因序列粘贴进去,扩增全长的话一般都是手工选取18～22bp长度,再加入内切酶碱基